Utilisation d’un test basé sur les cellules T pour surveiller l’efficacité de la thérapie antituberculeuse

Le suivi de l’efficacité de la thérapie antituberculeuse est crucial tant pour le patient individuel que pour mieux contrôler la propagation de la tuberculose. Nous avons étudié des patients atteints de tuberculose microbiologiquement confirmée, au moment du diagnostic et des mois après le début du traitement, en utilisant un test in vitro qui détecte Réponse de l’interféron-γ médiée par les lymphocytes T à des peptides sélectionnés de la protéine ESAT-cible antigénique précoce spécifique de Mycobacterium tuberculosis Tous les patients ont eu des résultats positifs au moment du diagnostic; cependant, des mois plus tard, la réponse aux peptides ESAT était encore détectable uniquement chez les patients présentant un isolement microbiologique et / ou absence d’amélioration clinique après traitement. Sur la base de ces données, nous concluons que notre test est un outil utile pour contrôler l’efficacité de la thérapie antituberculeuse

Nous avons étudié les patients inclus dans une étude antérieure Il y avait des hommes et des femmes d’âge moyen [± SD], ± ans Treize patients étaient blancs, étaient latino-américains, Les patients inclus dans la présente analyse étaient ceux disponibles pour le suivi clinique et de laboratoire L’étude a été approuvée par le comité d’éthique interne, et tous les patients ont donné leur consentement éclairé Tous les patients avaient une tuberculose microbiologique confirmée: avait une maladie pulmonaire, c.-à-d. Les résultats de la culture pleurale étaient positifs pour M tuberculosis, avaient une maladie disséminée, c.-à-d. que les résultats de culture de sang et de liquide pleural étaient positifs pour M tuberculosis, et avaient une lymphadénite, les deux avaient des résultats de PCR des échantillons de biopsie positif pour M tuberculosis Onze patients étaient séronégatifs et étaient séropositifs. Après le diagnostic, tous Les patients traités ont été traités avec des médicaments antituberculeux rifampicine, isoniazide, éthambutol et pyrazinamide Cinq patients séropositifs recevaient un HAART sans inhibiteurs de protéase alors qu’ils recevaient un traitement antituberculeuxA l’apparition de la maladie T et des mois après le diagnostic T, tous les patients ont été testés pour la réponse in vitro aux peptides ESAT et a subi une évaluation clinique, radiologique et de laboratoire Les patients ont été classés comme « répondeurs à la thérapie » si, à T, les résultats de culture des expectorations ou d’autres spécimens appropriés étaient négatifs pour M tuberculosis, une amélioration de les signes radiographiques thoraciques ou les signes locaux de la maladie pour la tuberculose extrapulmonaire ont été documentés, ils ne présentaient aucun symptôme respiratoire et constitutionnel (toux persistante, hémoptysie, fièvre, perte de poids ou douleur locale) et ils présentaient des valeurs normales pour les paramètres. de la maladie inflammatoire, c.-à-d. niveau de protéine C-réactive et taux de sédimentation érythrocytaire Patients w Il n’a pas démontré de réponse à T ont été testés à nouveau avec le test ELISPOT après plusieurs mois de traitement et ont subi une évaluation clinique et radiologique. Les cliniciens ont été aveuglés par les résultats ELISPOT, et les personnes réalisant les tests ont été aveuglés sur le statut du patient. les peptides ESAT – et ESAT – spécifiques ESAT ont été sélectionnés pour leur liaison HLA de classe II putative, comme décrit ailleurs Ensemble, les épitopes peptidiques conçus ont pu couvrir>% des haplotypes HLA de classe II présents. Les peptides lyophilisés ont été dilués dans du diméthylsulfoxyde. Les PBMC ont été séparés par des moyens standards, comme décrit ailleurs . En bref, les CMSP × ont été testées en double pour h à la fois avec des peptides sélectionnés une concentration de μg / mL et avec un pool de peptides ESAT à une concentration de μg / mL, PPD Statens Serum Institut, RT du lot à une concentration de μg / mL, la phytohémagglutinine Sigma à une concentration de μg / mL et la protéine ESAT-Lionex à une concentration de μg / mL. Les témoins négatifs comprenaient des PBMC non stimulées ou traitées avec du DMSO à la même concentration présente dans le peptide. solutions L’énumération des lymphocytes T spécifiques du stimulus circulant a été évaluée par ELISPOT pour la libération d’IFN-γ unicellulaire, comme décrit ailleurs Les taches ont été comptées en utilisant un système d’analyse vidéo ELISA-Spot automatisé La courbe caractéristique du récepteur AELVISA a été construite pour ELISPOT données à l’aide du logiciel LABROC http: // wwwGraphPadcom Sur la base de cette analyse, chaque résultat a été noté positif ou négatif, comme décrit ailleurs Le test exact de Fisher a été utilisé pour comparer les proportionsRésultats Nous avons étudié des patients tuberculeux actifs ayant un test in vitro réponses aux peptides ESAT et à la PPD à T figure A et B A T, mois après le diagnostic, tous les patients ont été testés à Comme le montre la figure A, à T, la réponse aux peptides ESAT était inférieure à la valeur limite pour les patients identifiés comme «répondeurs à la thérapie» des patients atteints de tuberculose pulmonaire qui sont devenus négatifs pour la culture et patients atteints de tuberculose extrapulmonaire En revanche, une réponse positive au test des peptides ESAT a été détectée chez les patients qui n’ont pas répondu au traitement au TP & lt; , comparé aux répondeurs Les patients qui n’ont pas eu une réponse de dosage à T ont été caractérisés à T a une maladie clinique sévère en raison de l’extension de la maladie et de mauvaises conditions liées à la nutrition De ces patients, ont eu la tuberculose pulmonaire et ont continué à les cultures de crachats positifs étaient séropositives, recevaient un traitement antirétroviral hautement actif, présentaient une tuberculose extrapulmonaire et continuaient d’avoir des résultats positifs dans les cultures de sang et de liquide pleural, étaient séropositives, mais ne recevaient pas de multithérapie.

Figure View largeDownload slideEvaluation de la réponse in vitro à la cible antigénique sécrétoire précoces ESAT – peptides sélectionnés A et dérivé protéique purifié PPD B au moment du diagnostic de la tuberculose T et après des mois de traitement antituberculeux TFigure View largeDownload slideEvaluation de la réponse in vitro au début cible antigénique sécrétoire ESAT – peptides sélectionnés A et dérivé protéique purifié PPD B au moment du diagnostic de la tuberculose T et après des mois de traitement antituberculeux D’autre part, une réponse à la PPD était encore présente indistinctement à T pour les deux groupes de patients. Pour un petit sous-groupe n = de l’ensemble du groupe de sujets, la réponse à la protéine ESAT intacte a été évaluée au fil du temps; cependant, aucune corrélation avec le résultat clinique n’a été trouvée. données non montrées Après des mois supplémentaires de traitement, les patients qui n’ont pas eu de réponse à T ont été cliniquement évalués et ont montré une résolution de la maladie clinique et M tuberculosis n’a pas été isolée. spécimens appropriés En outre, aucune réponse aux peptides ESAT n’a été trouvée données non montréesDiscussion Dans cette étude, nous avons montré qu’un test de diagnostic immunitaire in vitro basé sur la réponse aux peptides multiepitopiques sélectionnés ESAT peut être un outil utile pour surveiller l’efficacité de En fait, cette réponse peut être détectée au début de la maladie, et elle devient indétectable après des mois de traitement efficace, alors qu’elle est toujours présente chez les patients qui ne répondent pas au traitement. Une explication possible est que la sécrétion de M spécifique à la tuberculose les protéines, telles que l’ESAT, nécessitent des bacilles métaboliquement actifs et viables , et, par conséquent, des cellules T productrices d’IFN-γ spécifiques à l’ESAT-sel Les épitopes ect sont présents à haute fréquence pendant la phase active de la réplication bactérienne. Il a été démontré que ces lymphocytes T sont préactivés in vivo et capables de fonction effectrice rapide Cependant, après réception d’un traitement efficace, M tuberculosis cesse de se répliquer activement et la fréquence Cependant, la réponse de la mémoire à l’ensemble de la protéine ESAT reste. Ces données sont différentes de celles de la littérature qui montrent systématiquement que, dans le sang périphérique, les réponses immunitaires cellulaires à M tuberculosis augmentent avec le traitement antituberculeux en présence ou en l’absence de maladie VIH Cependant, ces chercheurs ont utilisé des antigènes M tuberculosis intacts et non spécifiques, tels que PPD, et n’ont pas utilisé de peptidesA diminution de l’IFN-γ in vitro la réponse à des peptides non sélectionnés par ESAT dans le cadre d’un traitement antituberculeux a déjà été montrée Cependant, dans ces études, aucune donnée n’est p Pour la première fois, à notre connaissance, nos résultats indiquent une corrélation entre la persistance d’une réponse positive aux peptides sélectionnés par ESAT et l’absence de réponse au traitement obtenir la description. Dans cette étude, les patients qui n’ont pas répondu à la thérapie après les premiers mois, finalement après des mois supplémentaires de traitement avait la résolution clinique et microbiologique de la maladie, indiquant qu’ils étaient des répondeurs lents; Les résultats de notre test ELISPOT sont encourageants, car le test peut aider à identifier ce manque de réponse. Un test in vitro de surveillance de la réponse au traitement peut être particulièrement utile pour la tuberculose extrapulmonaire car, pour cette pathologie, des procédures invasives sont nécessaires pour établir un diagnostic, et la répétition de ces procédures pour surveiller la réponse au traitement est clairement impossible. Il est important de noter que notre test a des résultats reproductibles, est facile à réaliser, fournit une réponse en quelques jours, est hautement spécifique et peut être utilisé pour Les principales limites de ce test sont sa sensibilité sous-optimale pour les patients atteints de tuberculose active%, par rapport à la tuberculose confirmée par culture et la nécessité d’isoler les PBMC, bien qu’un dosage du sang total soit effectué chez des patients hétérogènes. En cours d’étudeAvant de pouvoir tirer des conclusions définitives, des études plus vastes incluant un plus grand nombre de patients l’uberculose est nécessaire Cependant, les données disponibles suggèrent que notre test peut être un outil utile pour surveiller l’efficacité de la thérapie antituberculeuse

Remerciements

Nous sommes reconnaissants envers tous les patients et le personnel médical et infirmier qui a participé à cette étude

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