Synthèse d’analogues d’endomorphine-2 cycliques d’affinité d’opioïdes mélangés avec des phénylalanines fluorées

Endomorphines

(EMs), Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 (EM-1) et Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2 (EM-2), sont des ligands sélectifs du récepteur MOP et de la

analgésiques endogènes les plus efficaces étant libérés en réponse à

stimulus de la douleur.1 EMs, administrés de manière centralisée,

présentent une activité antinociceptive élevée chez plusieurs modèles animaux de

douleur aiguë, inflammatoire et neuropathique2. Cependant, l’administration périphérique des EM rencontre

leur incapacité à pénétrer dans la barrière hémato-encéphalique (BHE) 3 du sang et à leur dégradation rapide par les peptidases.4 De nombreuses modifications chimiques ont été

développé pour augmenter la stabilité et la biodisponibilité des analogues électromagnétiques.5,6 Jusqu’à présent, seuls quelques-uns ont été signalés comme pouvant

au système nerveux central (SNC) et produire une analgésie après périphérique

Administration.7 − 10 Parmi les autres stratégies utilisées dans la recherche sur les peptides opioïdes, la cyclisation

avéré être un outil puissant pour générer des analogues avec une augmentation

stabilité chimique et enzymatique et propriétés pharmacodynamiques améliorées.11 La cyclisation peut être réalisée

pontage entre les extrémités peptidiques ou les chaînes latérales. Mis à part le disulfure

ponts dans des peptides contenant des résidus de cystéine, les plus souvent utilisés

Les liens de pont entre les chaînes latérales sont des liaisons amides et des liaisons urées.12 − 15Pendant les dernières années, nous nous sommes concentrés sur la synthèse

d’analogues cycliques basés sur la structure de EM-2 avec incorporation

acides aminés bifonctionnels qui facilitent la fermeture du cycle.16,17Dans cette étude, la cyclisation a été combinée avec l’introduction

d’acides aminés fluorés. Il est bien reconnu que le remplacement d’un

atome d’hydrogène ou un groupe fonctionnel par le fluor peut avoir un dramatique

effet sur l’activité biologique en améliorant la stabilité des protéines

contre la dégradation chimique et thermique. Dans les petites molécules, l’hydrogène

peut être substitué par le fluor avec peu d’influence sur leur liaison

aux récepteurs ou aux enzymes18.

les atomes de fluor augmentent la liposolubilité et augmentent donc la biodisponibilité.19 La liaison F fortement polarisée affecte

la conformation d’une molécule, qui peut mieux s’intégrer dans le récepteur

poche de liaison.20 Jusqu’à présent, seuls quelques

des acides aminés ont été introduits dans les analogues linéaires des EM.21,22Acides aminés fluorés, 4-fluorophénylalanine (4-F-Phe),

2,4-difluorophénylalanine (2,4-F-Phe), ou 4-trifluorométhylphénylalanine

(4-CF3-Phe), ont été incorporés dans la séquence Tyr / Dmt-c [d-Lys-Phe-Phe-Asp] NH2 (où Dmt = 2 ′ 6 ′ -diméthyltyrosine)

au lieu d’un résidu Phe en position 3 ou 4 (tableau 1). Douze nouveaux analogues cycliques ont été synthétisés en deux séries,

avec Tyr ou Dmt en position 1. Dans chaque ensemble, les résidus Phe en position

3 ou 4 ont été successivement remplacés par 4-F-Phe, 2,4-F-Phe ou 4-CF3-Phe hémorroïdes. Les synthèses ont été réalisées par une phase entièrement en phase solide

méthodologie utilisant la chimie Fmoc / tBu avec l’hyper-acide

groupes labiles Mtt / O-2PhiPr pour l’amine sélective / carboxyle

protection de la chaîne latérale. La LC – analyse MS des mélanges bruts

révélé dans chaque cas la présence de deux pics principaux. L’un était le

peptide cyclique attendu, qui était toujours le produit principal, et

l’autre était un cyclodimère. Une observation intéressante était qu’un monomère / dimère

(M / D) était plus élevé dans le cas d’analogues contenant du Dmt et

également lorsque la substitution de Phe fluoré était en position 3. Le plus haut

Le rapport M / D a été trouvé pour les analogues avec 4-CF3-Phe en position

3 (Tableau 1) .Tableau 1 Données Physico-Chimiques

des analogues cycliquesLa liaison au récepteur

les affinités vis-à-vis des récepteurs MOP, DOP et KOP, déterminées contre [3H] DAMGO, [3H] [Ile5,6] deltorphine-2, et

[3H] nor-BNI, respectivement, sont résumés dans le tableau 2. Presque tous les analogues ont montré une affinité MOP dans le

gamme subnanomolaire. Les exceptions étaient les analogues 3 et 9, avec 4-CF3-Phe en position 3, qui étaient KOP

sélectif des récepteurs. Tous les analogues testés ont montré une forte affinité

Sites de liaison KOP et plutôt faible à DOP. Seul l’analogue 11 avec Dmt et 2,4-F-Phe en position 4 affichait une affinité pour les trois

les récepteurs opioïdes; dans la gamme subnanomolar à la MOP et KOP et

dans la gamme nanomolaire au récepteur DOP. Analogues incorporant Dmt

n’a pas eu d’affinité significativement accrue à l’un des trois

récepteurs récepteurs d’opioïdes par rapport aux analogues contenant du Tyr.Tableau 2Opioïde Receptor Liaison du Pentapeptidesa cyclique Cependant, il est intéressant de noter que l’introduction

d’un résidu Dmt plus stériquement encombré au lieu de Tyr est probablement

responsable d’une diminution de la formation de cyclodimères dans le Dmt contenant

analogues. Une restriction drastique de la cyclodimérisation a été observée

quand un groupe CF3 plus volumineux était présent sur le résidu Phe

en position 3 mais pas 4. La résistance des analogues cycliques

à la dégradation enzymatique a été testé in vitro par incubation

avec un homogénat de cerveau de rat pendant 90 min et en analysant les mélanges obtenus

par RP-HPLC pour évaluer la quantité d’un peptide restant (aire%). Tout

les analogues cycliques ont peu dégradé, pas plus de 7%,

tandis que EM-2 était presque complètement digéré après 90 min (tableau 1). Les profils pharmacologiques des analogues 1 et 12 ont été évalués in vitro sur les trois récepteurs opioïdes dans le test de mobilisation du calcium.

Ce test fonctionnel a déjà été utilisé et validé pour l’investigation

le profil pharmacologique de l’opioïde classique et de la nociceptine / orphelinine

Ligands des récepteurs (NOP) .23,24 Dans cet essai, le

Cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant un opioïde recombinant humain

les récepteurs et les protéines G chimériques ont été utilisés pour surveiller les changements de calcium23. Les courbes de concentration et de réponse de

tous les composés testés ont été obtenus et les puissances agonistes calculées

(pEC50) et les efficacités (α) des analogues sont résumés

dans le Tableau 3. Au niveau du récepteur MOP, tous les composés

sauf pour 3 et 9 (contenant le résidu 4-CF3-Phe en position 3) stimulé la libération de calcium avec

puissance élevée et efficacité. Ils ont imité l’effet stimulant de

EM-2, montrant des effets maximaux similaires et des valeurs plus élevées de puissance

(8.17 – 8.78). Le peptide 11 était 10 fois plus puissant

que EM-2. Les composés 3 et 9 ont montré très

faible efficacité (α < 0.1). Au niveau du récepteur DOP, les composés 2, 3, 7, 9 et 12 étaient complètement inactifs, 1 seulement faiblement stimulé

mobilisation du calcium (α ≈ 0,14 et pEC50 ≈

6.3), tandis que pour 8 une réponse de concentration incomplète

courbe a été obtenue. Composés 4 et 10 affichés

effets maximaux plus faibles que DPDPE (Tyr-c (d-Pen-Gly-Phe-d-Pen) OH) (0,20 et 0,21, respectivement) et une activité similaire

(7,29 et 7,47, respectivement). Les composés 5, 6 et 11 se sont comportés comme des agonistes partiels (α ≈

0,50, 0,27 et 0,37, respectivement), modérée (6,90 et 6,79

pour 5 et 6, respectivement) ou élevé (8.06

pour 11) les puissances. Au niveau du récepteur KOP, les peptides 1, 4, 7 et 11 sont stimulés

mobilisation du calcium avec des effets maximaux légèrement plus faibles que

avec la dynorphine A, les autres cyclopeptides ont montré une réduction significative

des effets maximaux. En termes de puissance, le pEC50 le plus faible (∼ 7,14) a été obtenu pour l’analogue

avec 8,75 pour la dynorphine A). Tous les autres composés affichaient des valeurs élevées

de puissance (7,93 – 8,98), les analogues 4 et 11 étant exceptionnellement puissants (8,98 et 8,87, respectivement).

Les résultats de l’essai de mobilisation du calcium étaient bien corrélés avec les résultats

de l’essai de liaison (voir l’information de support) .Tableau 3Effets des pentapeptides cycliques chez le recombinant humain

Récepteurs d’opioïdes couplés à la signalisation de calcium via des protéines G chimériques Des expériences in vivo ont été réalisées

sur des souris Swiss albinos mâles (CD1). L’activité antinociceptive a été évaluée

pour deux analogues, 10, qui affichait la plus grande affinité

à MOP et KOP, et 11, qui avait une grande affinité avec tous

trois types de récepteurs opioïdes. Le test de la plaque chauffante de la souris a été effectué

après i.c.v. et i.p. administration dans la gamme de doses 0.001 – 10

μ g / animal et 0,3 – 10 mg / kg, respectivement. Les deux analogues

produit des réponses antinociceptives dose-dépendantes après i.c.v. injection

(Figure ​ (Figure1) .1). Ces peptides étaient également efficaces

après administration périphérique (Figure ​ (Figure2),

which2),

qui a indiqué qu’ils étaient capables de traverser le BBB. Le peptide 11 était le plus puissant des deux et à 10 mg / kg produit

environ 84% de l’effet maximal possible (Figure ​ (Figure2) .2). Pour confirmer que l’action analgésique de 10 et 11 a été médiée par le système opioïde, sélective

MOP et KOP antagonistes, β -funaltrexamine (β -FNA) et

nor-binaltorphimine (nor-BNI), respectivement, ont été utilisés dans la dose

de 1 μ g / animal i.c.v. Même si les analogues 10 et 11 ont tous les deux montré une affinité élevée pour le MOP et le KOP, seul l’ARN-F

inversé l’effet antinociceptif de ces cyclopeptides (figure ​ (figure3) .3). Un tel résultat est en accord avec un

fait accepté que les effets antinociceptifs sont principalement médiés

par le MOP.Figure 1Dose – courbes de réponse déterminées dans l’essai de plaque chaude

souris. Les résultats sont exprimés en pourcentage (moyenne ±

Effet maximum possible (% MPE) pour l’inhibition en cas de saut induit

par i.c.v. injection d’un peptide. Nombre d’animaux … Figure 2Dose – courbes de réponse pour la plaque chauffante

inhibition du saut induite par i.p. injection d’analogues 10 et 11 (souris Swiss albinos mâles (CD1)). Nombre

d’animaux dans le groupe était 8.Figure 3Antagoniste de β -FNA (1 μ g / animal, i.c.v) et nor-BNI

(1 μ g / animal, i.c.v) sur l’inhibition du saut induite par

analogues 10 et 11 (100 ng / animal, i.c.v.).

Le nombre d’animaux par groupe était de 8. * p < 0,05 pour

analogique … En résumé, nos résultats indiquent

que les analogues contenant des résidus Phe mono- et difluorés étaient

pleine MOP et agonistes partiels KOP, montrant une grande puissance à la MOP

et les récepteurs KOP et beaucoup plus faible puissance et l’efficacité au niveau du récepteur DOP.L’action centrale des agonistes KOP produit une analgésie accompagnée de

certains effets dysphoriques et cette propriété a limité la thérapeutique

développement de cette classe de ligands.25,26 Cependant, certains

les preuves suggèrent que les agonistes mixtes MOP / KOP présentent moins d’effets secondaires.

MOP / KOP agonistes de la structure des alcaloïdes, tels que l’éthylcétazocine

(EKC), ont été connus et utilisés pour traiter la dépendance à la cocaïne.25,27 La douleur de combat est l’un des plus anciens domaines de la chimie médicinale,

mais celui où le vrai succès s’est révélé illusoire. Bien que récemment

fois un certain nombre d’analogues efficaces dérivés d’opiacés ont été développés

pour un usage clinique, l’analgésique opiacé idéal sans effet secondaire attribué

à l’utilisation de la morphine reste encore hors de portée. La recherche pour

un analgésique sûr, actif par voie orale, et non addictif basé sur l’opioïde

la structure continue.La démonstration que certains peptides cycliques

analogues des EM peuvent traverser le BBB est une avancée importante vers

les analgésiques à base de peptides. Les peptides ont plusieurs avantages

médicaments, y compris une activité élevée, une haute spécificité, une faible toxicité et

interactions médicamenteuses minimes et de médicaments. Nouveaux cyclopeptides signalés

ici qui ont un profil d’affinité opioïde mixte peut représenter encore un autre

approche dans la recherche d’analgésiques EM plus sûrs, et d’autres tests in vivo sont maintenant en cours.

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