Détermination de l’anticorps sérique contre la toxine adénylate cyclase de Bordetella pertussis chez les enfants vaccinés et non vaccinés et chez les enfants et les adultes atteints de coqueluche

La présence d’anticorps dirigés contre la toxine adénylate cyclase ACT a été notée à la suite de l’infection à Bordetella pertussis. Étant donné que l’ACT n’est présentement dans aucun vaccin anticoquelucheux acellulaire, il a été considéré comme un antigène potentiel à utiliser dans les tests ELISA. par des tests ELISA et Western blot dans des échantillons sériques obtenus d’enfants non vaccinés, d’enfants vaccinés avec plusieurs vaccins antidiphtériques et antitétaniques DTC, d’enfants vaccinés avec des vaccins contenant des composants anticoquelucheux acellulaires en association avec des anatoxines diphtérique et tétanique DCaP, Les infections primaires avec B pertussis ou Bordetella parapertussis ont stimulé une réponse immunitaire vigoureuse à l’ACT En revanche, les patients chez qui les vaccins DTC et DTaP ont échoué ont eu des réponses d’anticorps ACT minimes L’absence d’une réponse d’anticorps ACT significative chez les enfants qui le vaccin L’échec est intéressant mais semble exclure l’utilisation de l’ACT dans les tests de diagnostic

La coqueluche est une maladie infectieuse retrouvée chez les enfants et les adultes et causée par la bactérie Gram négatif Bordetella pertussis B pertussis présente un certain nombre de facteurs de virulence, dont les fimbriae, la pertactine PRN, la coqueluche, l’hémagglutinine FHA, le lipooligosaccharide et l’adénylate cyclase toxine ACT ACT est un facteur de virulence important de B pertussis qui perturbe le métabolisme de l’hôte cyclique ‘,’ – adénosine monophosphate cAMP ACT pénètre dans une variété de cellules mammifères et peut inhiber la fonction cytotoxique microbicide des neutrophiles, monocytes, et cellules tueuses naturelles Sa contribution à la coqueluche clinique peut résulter d’une altération des défenses de l’hôte ou d’un effet direct sur la muqueuse respiratoire. L’utilisation de l’ACT B pertussis pour le diagnostic de la coqueluche a été décrite par Confer et Eaton Nasopharyngeal Taux détectables induits par cfu d’AMPc Des études d’immuno-empreinte antérieures ont recherché des anticorps contre ACT Dans des échantillons sériques prélevés sur des nourrissons, des enfants et des adultes Farfel et al ont trouvé des anticorps anti-ACT dans les échantillons sériques des groupes suivants: patients atteints de coqueluche, nouveau-nés, enfants vaccinés entre Arciniega et al ont trouvé des anticorps anti-ACT dans les échantillons sériques de patients atteints de coqueluche mais pas dans les échantillons sériques des nourrissons vaccinés avec le vaccin compensation. contenant de la coqueluche à cellules entières en association avec des anatoxines diphtérique et tétanique vaccin DTCDans le s, plusieurs grands essais d’efficacité vaccinale ont été réalisés pour l’évaluation de vaccins avec des composants anticoquelucheux acellulaires en association avec des anatoxines diphtérique et tétanique Vaccins DTaP Dans ces essais, le diagnostic a été établi dans de nombreux cas, par la démonstration d’une augmentation du titre d’anticorps en réponse au PT et à d’autres B p antigènes ertussis FHA, PRN et fimbriae Parce que ⩾ de ces antigènes était contenu dans chacun des différents vaccins DTaP évalués, on craignait que cela entraîne une identification disproportionnée des cas chez les patients du groupe témoin par rapport aux patients qui ont été vaccinés et Par conséquent, il semblerait idéal d’utiliser un antigène spécifique de l’espèce Bordetella et non inclus dans un vaccin DTaP pour le diagnostic sérologique. B ACT pertussis a été cloné dans Escherichia coli par recombinant. Contrairement à l’immunoblot, ELISA permet la détermination de valeurs spécifiques d’anticorps ACT quantitatives. Pour mieux comprendre la réponse immunitaire humaine à l’ACT B pertussis, nous avons examiné les anticorps contre l’ACT par ELISA et immunoblot dans des échantillons de sérum obtenus à partir de receveurs de vaccin DTC ou DTaP; les enfants non vaccinés avec ou sans coqueluche; les adultes atteints de coqueluche; Les bénéficiaires du DTC ou du DCaT qui ont par la suite eu la coqueluche; et les enfants non vaccinés atteints de maladie de Parapertussis B

Matériaux et méthodes

Echantillons sériques Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des enfants ayant participé à des études d’efficacité vaccinale et chez des enfants allemands et des adultes atteints de coqueluche. Le consentement éclairé a été obtenu auprès de sujets d’étude ou de leurs parents ou tuteurs. Les échantillons de sérum ont été prélevés spécifiquement pour déterminer les anticorps contre les antigènes B pertussis. L’antigène et les réactifs B pertussis ACT qui avait été produit dans E. coli a été utilisé avec gentillesse par le Dr J et les services humains et ceux des sites d’essais spécifiques en Suède, Italie et Allemagne. Coote, Université de Glasgow La possibilité de réactions croisées dans les échantillons sériques aux antigènes E coli résiduels a été évaluée dans une étude pilote. Les échantillons de sérum ont été incubés avec la souche parentale E coli ~ cellules / ml à ° C pendant une nuit; Les résultats d’ELISA obtenus à partir d’échantillons ayant subi ce traitement ont été comparés aux résultats obtenus à partir d’échantillons qui n’étaient pas incubés avec la souche E coli parente, et il n’y avait pas de différence significative entre les échantillons. les groupes À notre connaissance, il n’existe pas de sérum de référence pour les anticorps anti-ACT, et donc, pour la standardisation, une préparation lyophilisée d’un échantillon de sérum humain avec des anticorps contre d’autres antigènes B pertussis, fournie par l’Institut national des étalons biologiques , Royaume-Uni NIBSC, code /, a été utilisé comme référence interne dans cette étude. Cette préparation a été associée à un anticorps anti-ACT à une concentration de U / mL Tous les autres réactifs utilisés étaient de qualité analytique, sauf indication contraireDetermination of titers of ACT anticorps par ELISA ELISA a été utilisé pour déterminer les titres des anticorps IgG ACT dans chacun des échantillons de sérum. Les plaques de microtitration ont été recouvertes de μL d’ACT à une concentration de μg / mL dans du tampon de revêtement de carbonate pH h à température ambiante Après blocage et lavage avec du PBS / Tween /% de sérum foetal de veau PBSTF, dilutions du sérum de référence Des échantillons et des échantillons de sérum à tester dans PBSTF ont été réalisés sur la plaque et incubés h à température ambiante. Les puits témoins négatifs ont été traités de manière similaire mais ne contenaient pas d’échantillons de sérum Après l’incubation avec IgG conjugué à la peroxydase humaine; Sigma dans PBSTF pour h à température ambiante, les puits ont été lavés, et μL de solution de substrat contenant du peroxyde d’hydrogène-tétraméthylbenzidine a été ajouté à tous les puits couleur a pu se développer pour min à température ambiante, et μL d’acide sulfurique à une concentration de mol / L a été ajouté pour arrêter la réaction Les plaques ont ensuite été lues à une densité optique de nm sur un lecteur de plaque Anthos Anthos Labtec Instruments, AutricheLe point de coupure pour chaque test individuel a été calculé comme densité optique moyenne pour les puits témoins négatifs plus SDs Sur la base des dosages, la limite de détection de ce test a été établie car les unités ELISA par millilitre UE / mL des niveaux sériques / anticorps standard dans les échantillons donnant des estimations inférieures à la limite de détection ont été considérées comme indétectables. les échantillons de sérum contre le sérum de référence / selon les principes du bioessai de ligne parallèle multiple, par comparaison de la réponse de dosage transformée enregistrer la concentration en utilisant des dilutions in dans la gamme linéaire La précision du dosage a été évaluée par des tests supplémentaires effectués sur différents jours sur des échantillons de sérum. Le coefficient de variation était% Dans tous les cas, une analyse de variance a permis d’évaluer la linéarité et le parallélisme qui sont requis comme mesure de la validité statistique de l’analyse Quatre-vingt-quinze pour cent des limites fiduciales ont été calculées, et le test t de Student a été utilisé pour la comparaison entre les groupes; P & lt; L’antigène -kDa ACT μg et un poids moléculaire du marqueur, – kDa ont été soumis à un gel de trisglycine% acrylamide Invitrogen en présence de SDS-PAGE, puis transférés à la nitrocellulose par électrophorèse. Après lavage et blocage, les bandelettes individuelles ont été On a ensuite fait réagir avec le sérum de référence ou les échantillons de sérum de test: pendant une nuit à température ambiante. Les bandelettes ont été lavées puis incubées avec un conjugué IgG peroxydase humaine. Les bandelettes ont ensuite été colorées avec des comprimés de diaminobenzidine comme substrat de peroxydase. Scanner et analysé en utilisant le logiciel Adobe Photoshop, version La version du quantificateur Phoretix D a été utilisée pour détecter l’intensité des bandes à kDa pour les échantillons de test et de référence Pour la standardisation, le rapport entre l’intensité d’un échantillon test et l’intensité d’une référence échantillon provenant de la même empreinte a été utilisé pour exprimer les résultats Un rapport ⩾ a été considéré comme p ositif

Résultats

Les titres moyens géométriques de postimmunisation ACT GMT d’anticorps dans les échantillons sériques de nourrissons sains ayant reçu des vaccins DT, DTP ou DTaP diphtérique-tétanique sont présentés dans le tableau Treize nourrissons recevant ou recevant des vaccins DT homologués en Allemagne ou en Suède; les nourrissons qui ont reçu ou reçu des doses de vaccins DTC autorisés ont reçu le vaccin Connaught homologué aux États-Unis, ont reçu le vaccin Lederle homologué aux États-Unis et ont reçu le vaccin Evans Medical homologué au Royaume-Uni; et reçu ou doses de vaccins DTaP expérimentaux Neuf nourrissons ont reçu un vaccin à base de PT et de FHA fabriqué par SmithKline Beecham; les nourrissons ont reçu un vaccin composé de PT, FHA et PRN Chiron; les nourrissons ont reçu un vaccin à base de PT, de FHA et de PRN, fabriqué par SmithKline Beecham; les nourrissons ont reçu un vaccin composé de PT, de FHA, de PRN, de type fimbriae Lederle / Takeda; et les nourrissons ont reçu un vaccin à base de PT, de FHA, de PRN, de type fimbriae et de type fimbriae de type Connimb-Canada.

Tableau View largeTélécharger slideMoyennes moyennes géométriques GMT de l’anticorps contre la toxine adénylate cyclase ACT dans des échantillons sériques d’enfants ayant reçu – des doses de diphtérie, d’anatoxine tétanique et de coqueluche acellulaire DTC, des composants anticoquelucheux acellulaires en association avec des anatoxines diphtérique et tétanique DTaP ou diphtérie-tétanos Vaccins DTTable View largeTélécharger la diapositiveTypes moyens géométriques GMT des anticorps dirigés contre l’adénylate cyclase toxine ACT dans des échantillons sériques d’enfants ayant reçu des doses de diphtérie, d’anatoxine tétanique et de coqueluche acellulaire DTC, des composants anticoquelucheux acellulaires en association avec des anatoxines diphtérique et tétanique DTaP, ou diphtérie vaccins contre le tétanos DT Comme on peut le voir, tous les échantillons sériques de ces nourrissons et enfants vaccinés présentaient de faibles valeurs du tableau anticorps contre ACT par rapport aux valeurs des échantillons sériques obtenus chez des enfants non vaccinés atteints d’infections B pertussis ou B parapertussis. échantillons du receveur DT-, DTP- et DTaP Cependant, chez les receveurs du vaccin DTC Evans et chez les receveurs du vaccin DTC Lederle, les valeurs sériques ELISA étaient supérieures de plus de la valeur sérique moyenne UE / mL pour les receveurs DT. Ces valeurs étaient EU et mL, pour les receveurs du vaccin Evans DP, et, et EU / mL, pour les receveurs du vaccin Lederle DTC

Tableau View largeTélécharger slideProduits moyens géométriques GMT de l’anticorps contre la toxine adénylate cyclase ACT dans des échantillons de sérum de convalescence prélevés chez des enfants vaccinés ou non vaccinés contre la coqueluche à Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussisTable View largeTélécharger DiapositiveProduits moyens géométriques GMT d’anticorps contre la toxine adénylate cyclase ACT Les valeurs ELISA de l’anticorps anti-ACT dans des échantillons de sérum en phase de convalescence provenant d’enfants préalablement vaccinés ou non vaccinés atteints de coqueluche due à B pertussis ou à B parapertussis, dans des échantillons de sérum de phase convalescente obtenus à partir d’enfants préalablement vaccinés ou non vaccinés par des infections à Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis. les infections sont présentées dans le tableau Chez les enfants non vaccinés, les TMG sériques après coqueluche due aux infections B pertussis ou B parapertussis étaient élevées: EU / mL et EU / mL, respectivement – et -plus supérieures aux TMG chez les nourrissons non vaccinés Seulement des sujets , chez un nourrisson de plus d’un mois, avait un titre bas dans le sang prélevé en phase de convalescence, EU / mL. En revanche, les TMG dans les échantillons de sérum en phase de convalescence obtenus chez des sujets chez lesquels la vaccination avait échoué étaient légèrement plus élevés. les échantillons de sérum prélevés chez des sujets pour lesquels le vaccin DTC a échoué étaient EU / mL et EU / mL dans les échantillons sériques de sujets pour lesquels le vaccin DTaP Lederle / Takeda a échoué – et plus élevé que le GMT dans des échantillons sériques non vaccinés. nourrissons Des échantillons de sérum en phase acupuncture et en phase de convalescence étaient disponibles chez les enfants ayant présenté un échec du vaccin DTC. Aucune augmentation du titre n’est survenue; la GMT en phase aiguë et la GMT en phase de convalescence étaient toutes les deux EU / mL As les résultats des essais d’efficacité des vaccins menés par les membres de notre groupe et d’autres , les maladies cliniques des enfants ayant reçu le vaccin DTC et DTaP En moyenne, les échecs étaient moins sévères que ceux des enfants non vaccinés Lorsque l’on compare les maladies des groupes vaccinés, les maladies chez les patients ayant reçu le vaccin DCaT semblent moins typiques de la coqueluche classique que celles chez les patients ayant reçu le vaccin DTC. Le vaccin DTC a échoué avec une combinaison de toux paroxystique, de vomissements ou de vomissements post-traumatiques, alors que seulement chez les patients pour lesquels le vaccin DCaP a échoué, des résultats cliniques similaires ont été obtenus sur les échantillons de sérum prélevés chez les enfants. sujets atteints de coqueluche en raison d’une infection à B pertussis ou B parapertussis, seuls les sujets atteints d’infections à B pertussis ne présentaient pas d’immunoblot En revanche, seuls les patients ayant reçu le vaccin DTC de Lederle ont obtenu un résultat d’immunoblot positif, et aucun des patients recevant le vaccin Lederle / Takeda DTaP n’a eu de résultats d’immunoblot qui étaient positifs pour le tableau des anticorps ACT. La vaccination a échoué chez les personnes ayant reçu le vaccin DTC et chez qui le vaccin DCaP a été administré, mais chez les adultes recevant le vaccin DCaP, les résultats d’immunoblot sont faiblement positifs. Infections à B pertussis En utilisant ces échantillons de sérum, nous avons effectué des tests ELISA pour déterminer les valeurs d’anticorps contre PT, FHA, PRN et fimbriae, et nous avons maintenant déterminé les valeurs d’anticorps ACT ELISA. et ce titre a persisté pendant les mois de suivi. Ce schéma est différent de celui trouvé pour PT, mais il est quelque peu similaire à celui trouvé pour FHA et PRN

Discussion

Chez les enfants âgés de 0 à 5 ans, les anticorps anti-ACT retrouvés étaient probablement attribuables à des infections à Bordetella non reconnues [,,] Dans cette étude, tous les échantillons de sérum prélevés chez des nourrissons sains recevaient de faibles valeurs d’anticorps contre ACT. , comme mesuré par ELISA De même, les TMG post-immunisation de tous les groupes vaccinaux, c’est-à-dire les receveurs du vaccin DTC et du vaccin DTaP, étaient également bas. Cependant, tous les receveurs du vaccin DTC Evans et les receveurs du vaccin DTC Lederle ont eu des titres d’anticorps ACT modérément élevés et EU / mL et, EU et mL, respectivement. Chez les receveurs de Lederle DTP avec des titres élevés, aucun résultat Western blot n’a été positif. Les faibles titres d’anticorps ACT dans les échantillons sériques des nourrissons non vaccinés Dans les échantillons de sérum de presque tous les patients en bonne santé qui ont reçu le vaccin sont d’intérêt Ces valeurs pourraient être le résultat d’anticorps résiduels, Cependant, cela semble improbable, car il n’y avait pas de différence significative dans les TMG des groupes dont les échantillons de sérum ont été obtenus au cours de la deuxième année de vie, comparés à ceux des groupes dont les échantillons de sérum ont été obtenus au bout de plusieurs mois. En outre, on peut s’attendre à ce que <% des nourrissons aient un titre mesurable d'anticorps acquis par voie transplacentaire résiduelle à l'âge de quelques mois Il existe des explications plus probables des valeurs d'anticorps ACT présentes dans les échantillons sériques pertussis ACT est un membre de la famille des toxines à répétition des cytotoxines, qui sont également produites par E coli et d'autres bactéries gram-négatives Parce qu'il existe une similitude entre les séquences d'acides aminés du domaine c-terminal d'ACT et celles des hémolysines de E. coli et d'autres bactéries gram-négatives, il est possible que les faibles titres que nous avons notés soient attribuables à des anticorps à réaction croisée générés en réponse à E co A l'appui de cette hypothèse, Arciniega et al ont étudié des échantillons de sérum prélevés chez des nouveau-nés et leurs mères et noté que les échantillons contenaient des anticorps contre ACT et l'α-hémolysine de E. coli. possibilité concerne la production d'ACT au cours du métabolisme humain Spécifiquement, l'ACT catalyse la synthèse de l'AMPc dans les cellules eucaryotes, qui agit comme un messager dans l'action de nombreuses hormones Il est possible que ACT soit libéré de la cellule dans certaines circonstances, Cependant, Goyard et al ont trouvé que l'ACT eucaryote contenait un épitope étroitement apparenté à celui spécifié par une pertussis B conservée. séquenceLes titres élevés dans des échantillons de sérum en phase de convalescence obtenus chez des patients atteints de coqueluche en raison d'une infection par B pertussis ou B parapertussis suggèrent la possibilité d'utiliser un antigène ACT détection par ELISA pour le diagnostic de la coqueluche Cependant, il est apparent que les résultats obtenus avec l'antigène ACT sont inférieurs à ceux obtenus avec l'antigène PT. L'anticorps contre ACT est moins spécifique que l'anticorps contre PT et, parce que ACT est commun aux espèces Bordetella, L'absence d'anticorps dirigés contre l'ACT ne présente aucun avantage par rapport à la détection des antigènes FHA ou PRN. L'absence de réponse anticorps ACT significative chez les enfants pour lesquels les vaccins DTC ou DTaP ont échoué suscite un intérêt particulier. Dans ce phénomène, un enfant répond à l'exposition initiale à tous les épitopes présentés de l'agent infectieux ou du vaccin. Avec une exposition répétée lorsqu'il est plus âgé, l'enfant répond préférentiellement aux épitopes partagés avec l'agent infectieux ou le vaccin d'origine. avoir des réponses à de nouveaux épitopes de l'agent infectieux moins marqués que la normale, car les deux vaccins contenaient plusieurs ntigens, PT, FHA, PRN, et fimbriae, les patients qui avaient été vaccinés ont répondu aux antigènes avec lesquels ils avaient été amorcés et n'ont pas répondu au nouvel antigène, c'est-à-dire ACT associé à l'infection. plus élevé chez les patients pour lesquels la vaccination DTC a échoué que chez les patients pour lesquels la vaccination DCaP a échoué Ceci suggère la possibilité que de petites quantités d'ACT étaient présentes dans le vaccin DTC Cette possibilité est confirmée par la découverte de titres légèrement plus élevés d'ACT après vaccination. Les données sur la désintégration des anticorps après l'infection chez les adultes sont également révélatrices. La structure de la désintégration de l'anticorps contre PT est différente de celle des anticorps anti-ACT, FHA, PRN et fimbriae La persistance des anticorps dirigés contre ces derniers peut résulte d'une stimulation continue par des antigènes croisés provenant d'autres agents infectieux L'anticorps anti-PT diminue plus fortement parce que cet antigène est B pertussis excl usive

Remerciements

Nous remercions le Dr J Coote, pour la fourniture de l’antigène ACT, le Dr Seema Mattoo, pour des conseils utiles, et le Dr P Mastrantonio et le Dr E Reizenstein, pour avoir fourni les échantillons de sérum obtenus respectivement en Italie et en Suède

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