Bocavirus humain chez les enfants hospitalisés pour une gastro-entérite aiguë: étude cas-témoin

Contexte Le bocavirus humain HBoV a été récemment découvert chez des enfants souffrant de maladies respiratoires et de gastro-entérite. Le rôle de l’HBoV dans la gastro-entérite humaine demeure incertain et, à notre connaissance, aucune étude cas-témoins n’a étudié la relation entre HBoV et gastroentérite. L’HBoV a été détectée en utilisant une réaction en chaîne de la polymérase La réaction en chaîne de la polymérase en temps réel a été utilisée pour quantifier les charges de HBoV dans les groupes de cas et de contrôle Les virus entériques courants ont été examinés en utilisant une enzyme Au moins 1 agent viral a été découvert dans 602% des cas. L’HBoV a été détecté dans 14 échantillons, et 9 ont été co-infectés avec soit le rotavirus 7 de 14 échantillons, soit le calicivirus 2 humain. De 14 [571%] de 14 des infections à HBoV sont survenues Septembre-décembre 2006 La plupart des enfants [857%] infectés par le HBoV avaient entre 7 et 18 mois Le pourcentage d’enfants infectés par le HBoV ne différait pas significativement entre les cas et les sujets témoins 35% vs 35%, et l’analyse statistique n’a pas corroboré une corrélation entre infection par HBoV et symptômes cliniques plus sévères Les différences de charge virale entre les 2 groupes n’étaient pas statistiquement significatives P = 09, par log-normal Test t de Student En outre, le gène partiel VP1 / VP2 de HBoV de cas Conclusion Une seule lignée génétique de HBoV a été révélée chez des personnes en Chine Malgré sa forte prévalence dans les échantillons de selles, notre étude ne confirme pas le rôle causal de l’HBoV dans la gastro-entérite.

La gastroentérite est une cause majeure de morbidité et de mortalité infantiles dans le monde Entre 15 et 2 millions de nourrissons et de jeunes enfants meurent chaque année de maladies ou de complications liées à la gastroentérite [1] Les bactéries entériques pathogènes sont des agents étiologiques importants de cette maladie. Une grande partie des cas de gastro-entérite est associée à des agents étiologiques viraux [2, 3], tels que les rotavirus, le calicivirus humain HuCV, les adénovirus et les astrovirus [4]. Cependant, les agents étiologiques ne sont toujours pas identifiés. En 2005, Allander et al [5] ont rapporté la détection d’un nouveau parvovirus humain chez des enfants atteints d’infections aiguës des voies respiratoires. Ce virus appartient au genre Bocavirus dans la sous-famille parvovirinae de la famille des parvoviridae. étroitement apparenté au parvovirus bovin et au virus infime des canines. Par la suite, l’HBoV a été fréquemment détecté chez des enfants présentant des infections respiratoires et une exacerbation de l’asthme dans le monde [6-11]. Plusieurs études ont confirmé que l’infection par le HBoV est effectivement associée à des symptômes respiratoires [12-15]. impliquée dans la diarrhée, et ses taux de détection chez les enfants atteints de gastro-entérite ont une gamme de 08% -91% Par conséquent, ce virus nouvellement identifié a été suggéré pour être un pathogène entérique, en plus d’être un pathogène respiratoire [16-19] Cependant, parce que la plupart des études évaluaient la prévalence de l’HBoV chez les enfants souffrant de gastro-entérite en l’absence d’enfants contrôles définis sans maladie entérique, le spectre clinique de l’HBoV et le rôle qu’il joue dans la gastro-entérite restent à clarifier. HBoV et d’autres agents étiologiques viraux majeurs chez les enfants hospitalisés pour une gastro-entérite de juillet 2006 à septembre 2007 à Lanzhou, La Chine et la relation entre HBoV et gastro-entérite

MATÉRIAUX, PATIENTS ET MÉTHODES

ction et traitement De juillet 2006 à septembre 2007, nous avons réalisé une étude de casecontrol pour étudier les agents viraux associés à la gastro-entérite chez des enfants hospitalisés souffrant de diarrhée et chez des enfants en bonne santé à Lanzhou, Chine, chez 397 enfants hospitalisés souffrant de diarrhée et 115 sujets témoins asymptomatiques Tous les enfants avaient moins de 5 ans, et leurs parents ont été interrogés pour déterminer les symptômes consécutifs ont été recueillis parmi les enfants qui ont été hospitalisés pour gastro-entérite dans le département de pédiatrie, le premier hôpital de l’université Lanzhou Lanzhou, en Chine définis comme ⩾3 selles molles au cours des 24-72 h précédents [20] Les patients étaient exclus de l’étude si les échantillons de selles disponibles étaient insuffisants pour une évaluation complète des agents viraux, si leurs selles présentaient des traces de sang claires ou s’ils avaient une autre maladie diagnostiquée, tels que les sujets de contrôle de la pneumonie étaient des enfants asymptomatiques qui ont visité le premier hôpital de Lan Centre de soins primaires pédiatriques de l’Université de Zhou pour un examen de routine et n’a pas eu de fièvre, de diarrhée, de vomissements ou de maladie respiratoire au cours des 3 semaines précédentes [21] Tous les sujets témoins de cette étude ont été sélectionnés suivi par téléphone, et les enfants qui avaient eu les symptômes cliniques mentionnés ci-dessus pendant la semaine après l’examen initial ont été exclus.Le consentement éclairé a été obtenu des parents de tous les enfants qui ont fourni des spécimens Le protocole de l’étude a été approuvé par l’hôpital comité d’éthique Tous les échantillons ont été conservés à -70 ° C jusqu’à analyse ultérieure. L’ARN viral et l’ADN ont été extraits de 140 μL de suspension fécale à 10% dans du sérum physiologique tamponné au phosphate avec QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen ARN et ADN simultanément, selon les instructions du fabricant. Détection de rotavirus L’antigène de rotavirus a été détecté à l’aide d’un kit ELISA commercial IDEIA Rotavirus; Dako, selon les instructions du fabricant Des échantillons positifs ont ensuite été génotypés G et P avec PCR nichée avec des amorces spécifiques, comme décrit ailleurs [22, 23] Détection de virus entériques communs Six virus entériques ont été identifiés par RT-PCR multiplex et PCR avec 3 ensembles d’amorces [24], comme suit: ensemble A, pour détecter les norovirus GI et GII, les sapovirus et les astrovirus; l’ensemble B, pour tous les adénovirus; et ensemble C, pour les rotavirus des groupes B et C. La RT-PCR multiplex et la PCR ont été réalisées selon un protocole décrit ailleurs [24] HBoV détection HBoV a été détectée dans l’ADN extrait par amplification PCR d’un fragment de 291 paires de bases. Gène NS1 avec amorce directe HBOV-1 5′-TATGGCCAAGGCAATCGTCCAAG-3 ‘et amorce inverse HBOV-2 5′-GCCGCGTGAACATGAGAAACAGA-3′, comme décrit ailleurs [11] Pour acquérir le gène partiel VP1 / VP2, nous avons utilisé l’amorce avant VP1 / 2-1 5’-GGACCACAGTCATCAGAC-3 ‘et amorce inverse VP1 / 2-2 5′-CCACTACCATCGGGCTG-3′, ciblant un fragment de 820 paires de bases [13] Le mélange réactionnel contenait 20 pmol de chaque amorce et 25 unités d’ExTaq ADN polymérase Takara Bio Après 5 min à 94 ° C, 35 cycles d’amplification à 94 ° C pendant 1 min, 54 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 2 min ont été réalisés, suivi d’une extension de 10 min à 72 ° Les produits de PCR positifs ont été purifiés en utilisant un kit de purification QIAquick PCR Qiagen et ont été séquencés par analyse InvitrogenSequence et accès Les séquences nucléotidiques et déduites des acides aminés du gène NS1 et du gène partiel VP1 / VP2 ont été comparées à celles des souches HBoV disponibles sur le site GenBank. Les analyses phylogénétiques ont été réalisées avec MEGA, version 31 [25] Le gène VP1 / VP2 a été soumis aux numéros d’enregistrement de la banque européenne EU400116-EU400128 PCR en temps réel pour HBoV Pour quantifier les charges de HBoV, des dosages PCR en temps réel ont été effectués Chaque mélange réactionnel de 25 μl consistait en 05 μL d’amorce frontale 5’-TGC AGA CAA CGC YTA GTT GTT T-3 ‘et amorce inverse 5′-CTG TCC CGC CCA AGA TAC A-3′ pour la cible NS1 de 88 paires de bases, 0125 μL de la sonde 5’-CCA GGA TTG GGT GGA ACC TGC AAA-3 ‘ [26], et 25 μL de PCR d’ADN échantillon ont été réalisés à 50 ° C pendant 2 min et à 95 ° C pendant 10 min, suivis de 50 cycles à 95 ° C pendant 15 s et à 60 ° C pendant 1 min. du vecteur pGEMT Easy Promega contenant le gène HBoV NS1 ont été utilisés comme standard de quantification. Le système de cyclage thermique en temps réel Rotor-Gene 3000 Corbett Research a été utilisé et les données ont été analysées à l’aide du logiciel Rotor-Gene Corbett Research, à l’aide d’une courbe standard. La charge virale minimale permettant une quantification reproductible était de 10 copies par reactionStatistical analysis La signification statistique des taux entre différents groupes a été testée en utilisant le test χ2 et le test exact de Fisher. La signification statistique des moyennes entre différents groupes a été testée en utilisant le test t de Student et le test t de Student. 115 SPSS

RÉSULTATS

Caractéristiques des patients L’âge des enfants atteints de diarrhée variait de 15 jours à 60 mois. Âge moyen ± écart-type, 1118 ± 93 mois La majorité des patients 748% avaient entre 0 et 12 mois Le rapport garçons / filles était de 18: 1 avec la diarrhée Sur les 397 échantillons, 239 602% contenaient au moins 1 agent viral Les rotavirus ont été identifiés dans 165 416% des 397 échantillons: G1 était le sérotype G le plus commun 91 sur 165; 552%, et P était le génotype P le plus commun 112 sur 165; 679% [8] Nous avons détecté HuCV dans 52 131% des 397 échantillons, astrovirus dans 13 échantillons 33%, adénovirus dans 22 échantillons 55%, et HBoV dans 14 échantillons 35% rotavirus des groupes B et C n’ont pas été détectés dans cette étude. Les HBV n’ont pas été détectés au printemps 2007 Parmi les échantillons positifs pour l’adénovirus, 773% 17 des 22 échantillons ont été collectés entre juillet et septembre 2007, ce qui indique une éventuelle épidémie d’adénovirus au cours de cette saison. Figure 1 La majorité des patients positifs pour les rotavirus, les astrovirus et les adénovirus étaient âgés de 0 à 12 mois, tandis que les virus HuCV et HBoV étaient principalement observés chez les enfants âgés de 7 à 18 mois. Figure 2 Sur les 14 échantillons HBoV positifs, 643% 9 étaient co-infectés par le rotavirus 7 ou le HuCV 2 Parmi les patients ayant des échantillons HBoVpositifs, 9 étaient des garçons et 5 des filles Parmi ces 14 patients, 7 avaient de la fièvre et 11 des vomissements, et la durée moyenne et la fréquence des diarrhées étaient de 46 jours. fois pe Tableau 1Prévalence de l’HBoV chez les enfants asymptomatiques L’âge de 115 enfants témoins asymptomatiques variait de 1 à 60 mois. Âge moyen ± écart-type, 141 ± 172 mois La majorité de ces enfants 783% avaient entre 1 et 18 mois. Les différences entre l’âge moyen P = 08, le test t de Student et le sexe P = 07, le test χ2 entre le groupe de cas et le groupe de contrôle n’étaient pas statistiquement significatives. L’HBoV a été détecté dans 4 35% des cas. 115 échantillons dérivés des sujets témoins; 4 cas HBoV-positifs ont été confirmés chez les sujets âgés de ⩽6 mois Les échantillons ont été recueillis en mars, mai, juin et août Le ratio garçons / filles était de 1: 1Analyse prophylactique de HBoV Tous les produits PCR du gène NS1 ont été confirmés par séquençage une étude antérieure a démontré que la plus grande variation dans le génome de HBoV était dans le gène VP1 / VP2, particulièrement à son extrémité 3 ‘[13], 12 échantillons HBoV-positifs ont été choisis au hasard pour amplifier VP1 / VP2 gènes nucléotides 4370-5189 du génome HBoV Les analyses phylogénétiques ont indiqué que tous les 12 gènes VP1 / VP2 de notre étude appartenaient au même groupe que les autres souches chinoises avec une homologie de séquence à 99%. 3Analyse quantitative de l’ADN du HBoV Nous avons utilisé la PCR en temps réel pour quantifier le HBV. La charge HBoV moyenne dans le groupe de cas était de 20 × 106 copies / mL de la gamme d’extrait, 26 × 104-12 × 107 copies / mL, et la charge HBoV moyenne dans le groupe témoin était de 15 × 107 copies / mL de gamme d’extrait , 18 × 106-13 × 109 copies / mL Il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les valeurs moyennes de ces 2 groupes P = 09, log-normal Tableaux des tests t de Student 1 et 2Association de HBoV avec gastro-entérite Dans notre étude, aucun des patients HBoV-positifs ne présentait de symptômes respiratoires HBoV prévalente chez les enfants souffrant de gastroentérite que chez les enfants asymptomatiques 35% vs 35% Tableau 2 L’HBoV n’était pas plus fréquente chez les enfants souffrant de gastro-entérite d’étiologie indétectable que chez ceux chez lesquels d’autres virus ont été détectés 31% vs 38%; P = 75, par χ2 test tableau 3 Lorsque les groupes de cas HBoV-positifs et HBoV-négatifs ont été comparés, ni les taux de fièvre chez les patients ni les taux de vomissements parmi les patients différaient statistiquement significativement P = 80, par χ2 test; et P = 06, par le test exact de Fisher; En outre, la durée moyenne et la fréquence de la diarrhée ne différaient pas statistiquement significativement P = 52 et P = 42, respectivement, selon le test t de Student car les distributions saisonnières et par âge de HBoV étaient similaires à celles du rotavirus et parce qu’il y avait souvent coïnfection. avec HBoV et rotavirus, nous avons comparé les symptômes cliniques entre le groupe d’enfants infectés par le rotavirus seul et le groupe d’enfants co-infectés par le rotavirus et le HBoV, et nous n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative entre ces deux groupes tous P & gt; 05, par le test χ2 et le test t de Student 4 Ces résultats suggèrent que l’infection par le HBoV n’a pas exacerbé les symptômes cliniques de la gastro-entérite

DISCUSSION

Nos résultats ont révélé que les virus entériques jouent un rôle important dans la diarrhée pédiatrique et que les agents viraux les plus courants causant une gastro-entérite sévère étaient les rotavirus du groupe A, suivi par HuCV La prévalence des adénovirus et des astrovirus était similaire à celle rapportée ailleurs [3, 27-29] Bien que certaines études aient détecté des taux élevés de rotavirus des groupes B et C dans les échantillons de selles d’enfants diarrhéiques [3, 30, 31], Ces découvertes [32-34] soutiennent l’association de bocavirus animaux avec des symptômes respiratoires et une gastro-entérite, en particulier chez les veaux et les chiots. Certaines études ont soulevé la question de savoir si le HBoV est une cause de gastro-entérite humaine [16]. , 35] On croit que l’HBoV est avalé lors d’une infection des voies respiratoires et ensuite excrété Récemment, le HBoV a été trouvé fréquemment dans des échantillons de selles d’enfants atteints de gastro-entérite. Vicente et al [18] ont trouvé que 48 91% des 527 échantillons de selles de patients espagnols souffrant de gastro-entérite Lau et al [17] ont détecté HBoV dans 21% des échantillons fécaux d’enfants souffrant de gastro-entérite à Hong Kong, et certains de ces patients avaient des symptômes respiratoires Ces études ont impliqué HBoV comme un virus entérique associé à la gastro-entérite. de HBoV et d’autres virus entériques, ce qui est inhabituel pour les pathogènes connus, soulève des inquiétudes sur le rôle causal du HBoV dans la gastro-entérite humaine. Des preuves supplémentaires sont donc nécessaires pour établir un lien entre HBoV et gastro-entérite. comparable aux taux précédemment rapportés [17-19] Nous avons également constaté que les infections à HBoV sont survenues plus fréquemment pendant les mois d’hiver 50% Chez les enfants de moins de 2 ans La co-infection par le HBoV et un autre virus était courante 643% chez tous les enfants HBoV positifs avec gastro-entérite La codétection la plus fréquente du HBoV et du rotavirus a confirmé l’idée que HBoV est un «innocent spectateur» de la gastro-entérite. Nos résultats étaient généralement cohérents avec les résultats précédents [11, 18, 36], et les taux similaires d’HBoV dans nos groupes témoins 35% et gastro-entérite 35% plaident également contre un rôle causal de l’HBoV dans la gastro-entérite. Les charges HBoV, mesurées dans nos groupes contrôle et gastro-entérite, étaient statistiquement non significatives. Sur la base des séquences géniques VP1 / VP2, tous les isolats HBoV retrouvés dans notre étude appartenaient à la même grappe que l’isolat ST2 original identifié par Allander et al [5], avec une homologie de séquence d’ADN à> 99% De plus, les autres souches de HBoV identifiées en Chine – y compris CZ, WL, BJ, et HK – sont dans le même groupe Ceci suggère qu’une seule lignée génétique l’âge de l’HBoV circule chez l’homme en Chine et que les virus HBoV retrouvés dans les voies respiratoires et entériques des humains en Chine appartiennent probablement à une seule lignée génétique. A notre connaissance, il s’agit de la première étude cas-témoin sur le lien entre HBoV En résumé, nous n’avons pas trouvé de différences statistiquement significatives dans la prévalence et les charges de HBoV entre les enfants avec et sans gastro-entérite La détection simultanée de HBoV et d’autres pathogènes entériques, tels que les rotavirus, était courante chez les enfants avec gastro-entérite. Nos résultats n’appuient pas le rôle de l’HBoV dans la gastro-entérite, malgré sa détection fréquente dans les échantillons fécaux du monde entier. Pour clarifier davantage le lien entre HBoV et gastro-entérite, les priorités futures devraient inclure des études cas-témoins cohortes d’échantillons de cas et témoins, l’établissement des méthodes sérologiques pour retracer les antigènes viraux et la réponse immunitaire, et le développement d’un modèle animal pour l’infection par le HBoV

Reconnaissance

Appui financier « 973 » Programme national de recherche fondamentale pour la Chine 2007CB310500 et Programme national de recherche et de développement en haute technologie de Chine 2006AA02A215Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit

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